|
|
Příprava expresních konstruktů interakčních partnerů fosducinu.
Koláčková, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Klíčová slova: SUG1, fosducin, G proteinová signální dráha, exprese, pGEX-4T-1, pST39 Fosducin je kyselý cytosolický protein, který se účastní regulace G proteinové signální dráhy v tyčinkách fotoreceptorů a má vliv na stresem indukovanou hypertenzi. Jedním z jeho důležitých interakčních partnerů je protein SUG1, který je součástí 26S proteasomu a řadí se do rodiny proteinů majících ATPasovou aktivitu. Tato bakalářská práce je součástí širšího výzkumu, který se snaží objasnit fyziologické funkce interakce mezi proteiny SUG1 a fosducinem. Hlavním cílem této práce bylo připravit expresní konstrukty proteinu SUG1 (lidská isoforma 1), které budou vhodné pro přípravu tohoto proteinu v bakteriích E. coli BL21 (Rosetta). Gen kódující protein SUG1 byl vnesen do dvou různých plasmidových DNA určených pro expresi rekombinantních proteinů v bakteriích. Sekvence připravených konstruktů byla ověřena pomocí sekvenace a následně byly provedeny expresní testy, které potvrdily produkci rekombinantních fusních proteinů. Hlavním výsledkem této bakalářské práce bylo zjištění, že se protein SUG1 (lidská isoforma 1) v expresním systému E. coli BL21 (Rosetta) dobře exprimuje. Toto zjištění je základem pro budoucí vývoj purifikačního protokolu a následné studium biofyzikálních vlastností tohoto proteinu a jeho interakcí s...
|
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Studium post translačních modifikací fosducinu
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá studiem úlohy posttranslačních modifikací fosducinu na jeho interakci s proteinem 14-3-3 a dále posouzení vlivu tvorby komplexu na tyto modifikace. Fosducin je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také v jiných tkáních. Přes mnohé experimenty jsou však jeho fyziologické funkce stále řešeným tématem. Spekuluje se o jeho vlivu při regulaci signální dráhy oční sítnice, krevního tlaku a exprese G-proteinů. Funkce fosducinu je regulována proteinem 14-3-3, jenž hraje roli v mnohých biochemických procesech. Tvorba komplexu mezi proteinem 14-3-3 a fosducinem vyžaduje fosforylaci dvou serinových zbytků v N-terminální doméně molekuly fosducinu. Úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je ovšem stále nejasná. V rámci této diplomové práce byly exprimovány proteiny 14-3-3ζ∆C a fosducin (s mutací Q52K) a úspěšně purifikovány. Ke studiu vlivu tvorby komplexu na posttranslační modifikace fosducinu bylo využito limitované proteolýzy a defosforylace. Experimenty ukázaly, že tvorba komplexu způsobuje významné zpomalení defosforylace Ser-54 i Ser-73 a proteolytické degradace, což indikuje protektivní funkci vazby proteinu 14-3-3ζ∆C. Úloha obou 14-3-3ζ∆C vazebných motivů obsahujících Ser-54 a Ser-73 pro interakci fosducinu s...
|
|
|
Studium interakce fosducinu s proteinem 14-3-3
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá interakcí proteinu 14-3-3 a fosducinu, které se podílejí na regulaci přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Tento přenos a zároveň i zesílení signálu jsou zprostředkovány G-proteinovou signální dráhou. Přenos signálu v závislosti na intenzitě světla je regulován dalšími proteiny včetně fosducinu. Fosducin je 33kDa protein, který je exprimován v mnoha tkáních, především ve fotoreceptorových buňkách oční sítnice. Jeho regulační funkce spočívá v inhibici funkce G-proteinu (transducinu). Při přenosu signálu je nutný rozpad transducinu Gtαβγ na podjednotku α (Gtα) a komplex βγ (Gtβγ). Pro opětovnou funkci je nutná reasociace heterotrimeru Gtαβγ, čemuž zabraňuje fosducin, a to vazbou na komplex Gtβγ. Nepřítomnost kompletního transducinu má za následek přerušení signální dráhy a snížení přenosu signálu. Při slabém osvětlení je nutné přenášený signál zesílit, a proto je v sítnici adaptované na tmu fosducin fosforylován, což rozruší jeho vazbu s Gtβγ podjednotkou a obnoví funkci transducinu. Fosforylovaný fosducin je vázán proteinem 14-3-3. Úloha proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je však stále nejasná. Protein 14-3-3 je 28 kDa protein, který je exprimován ve všech eukaryotických buňkách. Jedná se o protein s rigidní strukturou, který váže a reguluje funkce více...
|
|
|
Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace
Řežábková, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Fyzikální chemie Mgr. Lenka Řežábková Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace Role of the 14-3-3 proteins in the regulation of G-protein signaling Disertační práce Školitel: doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Konzultanti: doc. RNDr. Petr Heřman, CSc. doc. RNDr. Jaroslav Večeř, CSc. Praha, 2012 Abstrakt Proteiny 14-3-3 skrze vazbu na více jak 300 rozličných, především fosforylovaných, proteinů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci svého Ph.D. studia jsem se zabývala úlohou proteinů 14-3-3 v regulaci G proteinové signalizace. Proteiny 14-3-3 ovlivňují G proteinovou dráhu skrze interakci s negativními regulátory G proteinové kaskády - proteiny RGS a fosducinem. Tato disertační práce si klade za cíl pomocí rozličných biochemických a biofyzikálních metod pochopit strukturní podstatu mechanismu, kterým fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 reguluje biologickou aktivitu a funkci proteinů RGS3 a fosducinu. Povedlo se mi vyřešit strukturu komplexu RGS3/14-3-3 s nízkým rozlišením, která ukazála, že RGS doména proteinu RGS3 interaguje s málo konzervovanou oblastí proteinu 14-3-3 nacházející se mimo centrální kanál. Tato struktura společně s...
|
|
|
Příprava a charakterizace vazebných partnerů fosducinu.
Kylarová, Salome ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
AABBSSTTRRAAKKTT Fosducin (Pdc) je vysoce konzervativní fosfoprotein, který hraje důležitou roli v regulaci G- proteinové signalizace ve fotoreceptorových buňkách sítnice. Jeho funkce spočívá ve vazbě Gtβγ dimeru G-proteinu transducinu, čímž dochází k poklesu množství dostupného transducinu a modulaci signálu. Funkce fosducinu je negativně regulována prostřednictvím fosforylace a následné interakce s proteinem 14-3-3. Přestože je mechanismus této regulace již do jisté míry znám, narůstá zájem o poznání jeho dalších interakčních partnerů, jmenovitě SUG1 a CRX. SUG1 je podjednotka 26S proteasomu, která zajišťuje mnoho biologických funkcí, zejména pak degradaci mnoha transkripčních faktorů. Jeho úloha v regulační dráze fosducinu není stále dostatečně prozkoumána, ale pravděpodobně se podílí na transportu fosducinu do proteasomu k jeho degradaci. Pro bližší studium tohoto proteinu byly připraveny a testovány jeho čtyři různé expresní konstrukty pro nalezení optimálních podmínek pro jeho expresi a purifikaci. Výsledky těchto purifikací naznačily, že SUG1 vytváří stabilní a velmi dobře rozpustné vysokomolekulární oligomery. Tyto domněnky byly následně potvrzeny měřením dynamického rozptylu světla a analytickou ultracentrifugací. Jeho chování je však plně v souladu s jeho dobře prozkoumaným archeálním homologem,...
|
|
|
Příprava expresních konstruktů interakčních partnerů fosducinu.
Koláčková, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Klíčová slova: SUG1, fosducin, G proteinová signální dráha, exprese, pGEX-4T-1, pST39 Fosducin je kyselý cytosolický protein, který se účastní regulace G proteinové signální dráhy v tyčinkách fotoreceptorů a má vliv na stresem indukovanou hypertenzi. Jedním z jeho důležitých interakčních partnerů je protein SUG1, který je součástí 26S proteasomu a řadí se do rodiny proteinů majících ATPasovou aktivitu. Tato bakalářská práce je součástí širšího výzkumu, který se snaží objasnit fyziologické funkce interakce mezi proteiny SUG1 a fosducinem. Hlavním cílem této práce bylo připravit expresní konstrukty proteinu SUG1 (lidská isoforma 1), které budou vhodné pro přípravu tohoto proteinu v bakteriích E. coli BL21 (Rosetta). Gen kódující protein SUG1 byl vnesen do dvou různých plasmidových DNA určených pro expresi rekombinantních proteinů v bakteriích. Sekvence připravených konstruktů byla ověřena pomocí sekvenace a následně byly provedeny expresní testy, které potvrdily produkci rekombinantních fusních proteinů. Hlavním výsledkem této bakalářské práce bylo zjištění, že se protein SUG1 (lidská isoforma 1) v expresním systému E. coli BL21 (Rosetta) dobře exprimuje. Toto zjištění je základem pro budoucí vývoj purifikačního protokolu a následné studium biofyzikálních vlastností tohoto proteinu a jeho interakcí s...
|
host ::
RSS.